第一章　共聚焦显微镜的发展历史和背景

1955年，Marvin Minsky等首先提出了共聚焦显微镜的概念，用于研究活体脑组织中的神经网络。其原理是利用聚光镜将光线聚焦到神经组织的很小范围内，同时显微镜的物镜也准确聚焦在同一位置。由于聚光镜和物镜的焦点是相同的，所以这种显微镜被称为共聚焦显微镜。自此之后，Wilson和Sheppard等人对其光学理论做了进一步的发展。1974年，Maurice首次将共聚焦光学理论应用于眼科实践，发明了角膜内皮镜。而后，Bourne和Koester等人对其进行了进一步改进，发明出可用于临床的角膜内皮镜。这种基本设计，目前仍在眼库等临床实践中广泛应用。但是，由于角膜内皮镜使用较宽的扫描裂隙检测器（500μm）代替衍射限制的点状（20μm）或裂隙状光源，且由于物镜将光线分为两条路径（入射光/检测器），所以使用这种仪器虽然可以获得较大范围内的图像，但是图像的水平和轴向分辨率比使用相同有效光圈数量物镜的共聚焦显微镜要小得多。

1994年，Master和Thaer等人报道了可变裂隙、实时、非接触性角膜共聚焦显微镜对活体角膜的观察结果。经过二十余年的发展，目前，眼科临床型共聚焦显微镜已发展得比较成熟，在角膜的病理、生理、创伤愈合及疾病诊断方面都具备以往其他检查设备所无可比拟的优势。

现代临床中应用于角膜成像的共聚焦显微镜是将点状或裂隙状（即光的衍射极限）光源，聚焦到活体角膜很小的范围内，同时使用一个共聚焦的点状（小孔）或者裂隙状探测器来接收信号（图1-0-1）。光学校准可以排除或减少物镜所确定的聚焦平面（或体积）以上或以下的离焦反射信号，从而使得横断面（x、y轴）和轴向（z轴）的分辨率和对比度均有明显提高（图1-0-2）。尽管聚焦区域内的分辨率获得明显提高，但是每个点状或裂隙状光源探测器每次观察到的聚焦区域仅仅是角膜的很小一部分，所以必须通过快速扫描以获得更大的观察野，从而从整体上观察角膜的情况。通过照明装置和检测装置的同步运动可以达到以上要求。更重要的是，在角膜上通过沿z轴方向改变光源和检测器的聚焦平面，不需要移动就可以非侵袭性观察角膜光学切面。这种情况使得操作者能在足够大的放大倍数下原位观察角膜的正常结构及其病理生理过程，实现对细胞和亚细胞结构进行四维动态观察（x、y、z轴和时间）。

目前应用于眼科临床的共聚焦显微镜均属于实时、无创的裂隙光扫描共聚焦显微镜。与早期的共聚焦显微镜相比，它有两大明显的优势：①通过连续调整裂隙从而调节焦点在z轴的深度，可以使信噪比达到最大，以保证组织深度增加时光学切面的影像仍有较高的对比度；②使用裂隙光源可以得到较强的信号，当联合使用有效光圈数较高的物镜时，可通过调整裂隙连续获得共聚焦点，进而得到高清晰度的视频影像。由此共聚焦显微镜可以实现对活体组织超微结构的无创性观察。

（乐琦骅）