任务一　微生物培养基知识

任务要求

1.了解微生物细胞的化学组成

2.掌握微生物生长所需营养物质及其生理功能

3.理解微生物对营养物质吸收的不同方式

4.熟悉微生物的营养类型及其划分依据

5.掌握培养基配制原则

微生物与其他生物一样都是有生命活动的，都需要从生存环境中获取所需的各种营养物质来满足其生长繁殖过程中的物质和能量代谢。营养物质是微生物进行各种生命活动的物质基础。

一、微生物营养

那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质称为营养物质。而微生物从环境中获得和利用营养物质的过程称为营养。

微生物吸收何种营养物质主要取决于微生物细胞的化学组成。

（一）微生物细胞的化学组成

微生物细胞的化学成分以有机物和无机物两种状态存在。有机物包含各种大分子，它们是蛋白质、核酸、类脂和糖类等，占细胞干重的99%。无机成分包括小分子无机物和各种离子，占细胞干重的1%。

微生物细胞的元素构成包括C、H、O、N、P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等。其中C、H、O、N、P、S六种元素占微生物细胞干重的97%，称为常量元素；其他为微量元素。微生物细胞的化学元素组成的比例常因微生物种类的不同而异。

组成微生物细胞的化学元素分别来自微生物生长所需要的营养物质，即微生物生长所需的营养物质应该包含所有组成细胞的各种化学元素。这些物质概括为提供构成细胞物质的碳素来源的碳源物质、构成细胞物质的氮素来源的氮源物质和一些含有K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo元素的无机盐等。

（二）微生物的营养物质及其生理功能

1.碳源

凡是为微生物生长繁殖提供碳元素来源的物质称为碳源。碳源分为无机碳和有机碳两大类。凡只能利用有机碳源的微生物，叫作异养微生物（为数众多）；凡以无机碳源作唯一或主要碳源的微生物，叫作自养微生物（种类较少）。微生物利用的碳源物质见表3-1。对一切异养微生物来讲，其碳源同时又作为能源，因此，这种碳源又称之为双功能营养物。

碳源的生理作用主要有：碳源物质通过复杂的化学变化构成微生物自身的细胞物质和代谢产物；同时多数碳源物质在细胞内生化反应过程中还能为机体提供维持生命活动的能量，但有些以CO₂为唯一或主要碳源的微生物生长所需的能源则不是来自CO₂。

2.氮源

凡是为微生物生长繁殖提供氮元素来源的物质称为氮源。微生物营养上要求的氮素物质可以分为：

①空气中的分子态氮，少数固氮菌可以利用；

②无机氮化合物，绝大多数微生物可以利用；

③有机氮化合物，大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物可以利用。

铵盐作为氮源时会导致培养基pH值下降，称为生理酸性盐，而以硝酸盐作为氮源时培养基pH值会升高，称为生理碱性盐。

从微生物所能利用的氮源来看，一部分微生物不需要利用氨基酸作氮源，它们能把尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气等简单氮源自行合成所需要的一切氨基酸，因而可称为“氨基酸自养型生物”；反之，凡需要从外界吸收现成的氨基酸作氮源的微生物，就是“氨基酸异养型生物”。所有的动物和大量的异养微生物属于氨基酸异养型生物，而所有绿色植物和不少微生物（如细菌、酵母菌、多数放线菌和真菌）都是氨基酸自养型生物。

人类和为人类服务的大量动物都需要外界提供现成的氨基酸和蛋白质，而这些营养成分往往又是其食物或饲料、饵料中较缺少的。为了充实人和动物的氨基酸营养，除了继续向绿色植物索取外，还应更多地利用氨基酸自养型微生物，让它们将人和动物原先无法利用的廉价氮源，包括尿素、铵盐、硝酸盐或氮气等转化为菌体蛋白（单细胞蛋白或食用菌等）或含氮的代谢产物（谷氨酸等氨基酸），以丰富人类的营养和扩大食物资源，这对人类的生存和发展来说，具有十分积极的意义。

3.无机盐

无机盐或矿物质元素主要可为微生物提供除碳源、氮源以外的各种重要元素。无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等（表3-2）。

微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。

凡生长所需浓度在10^-3～10^-4mol/L范围内的元素，可称为大量元素（又称常量元素），如P、S、K、Mg、Na、Ca和Fe等；凡生长所需浓度在10^-6～10^-8mol/L范围内的元素，可称为微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo和Ni、Sn、Se、Cr、W、Co等。微量元素一般参与酶的组成或使酶活化（表3-3）。

无机盐的营养功能十分重要，可归纳如下：

4.生长因子

生长因子通常指那些微生物生长所必需且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。根据生长因子的化学结构和它们在机体中的生理功能的不同，可将生长因子分为维生素、氨基酸、嘌呤与嘧啶三大类（见表3-4）。维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢；有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必须在培养基中补充这些氨基酸或含有这些氨基酸的小肽类物质，微生物才能正常生长；嘌呤与嘧啶作为生长因子在微生物机体内的作用主要是作为酶的辅酶或辅基，以及用来合成核苷、核苷酸和核酸。

生长因子与碳源、氮源、能源有一定区别，即并非任何一具体微生物都需要外界为它提供生长因子。按微生物对生长因子的需要与否，可分成三种类型：

（1）生长因子自养型微生物　它们不需要从外界吸收任何生长因子，多数真菌、放线菌和不少细菌，如大肠杆菌、青霉菌、酿酒酵母等都属此类。

（2）生长因子异养型微生物　它们需要从外界吸收多种生长因子，才能维持正常生长，如各种乳酸菌、动物致病菌、支原体和原生动物等。

（3）生长因子过量合成型微生物　少数微生物在其代谢活动中，能合成并大量分泌某些维生素等生长因子，常可作为有关维生素的生产菌种。如可用阿舒假囊酵母或棉阿舒囊霉生产维生素B₂，可用谢氏丙酸杆菌、链霉菌和产甲烷菌生产维生素B₁₂等。

在配制培养基时，一般可用生长因子含量丰富的天然物质作原料以保证微生物对它们的需要，例如酵母膏、玉米浆、肝浸液、麦芽汁、米糠浸液或其他新鲜动、植物的汁液等。

5.水分

水是微生物生长所必不可少的。水在细胞中的生理功能主要有：

①起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；

②参与细胞内一系列化学反应；

③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；

④因为水的比热容高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，从而有效地控制细胞内温度的变化；

⑤保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素；

⑥微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛及病毒颗粒的组装与解离。

微生物生长的环境中水的有效性常以水活度值（a_w）表示，水活度值是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比，即：

a_w=p/p₀

式中，p代表溶液蒸气压；p₀代表纯水蒸气压。

纯水a_w为1.00，溶液中溶质越多，a_w越小。微生物一般在a_w为0.60～0.99的条件下生长，a_w过低时，微生物生长的迟缓期延长，比生长速率和总生长量减小。微生物不同，其生长的最适a_w不同（表3-5）。一般而言，细菌生长最适a_w较酵母菌和霉菌高，而嗜盐微生物生长最适a_w则较低。

6.能源

为微生物生命活动提供最初能量来源的物质，称为能源，通常分为辐射能和化学能。辐射能一般是指太阳能；化学能则指能够进行氧化还原反应并产生能量的物质，如Fe²⁺、S、H₂S、H₂、N等。

各种异养微生物的能源就是碳源。化能自养型微生物的能源是一些还原态的无机物质，如N、N、S、H₂S、H₂和Fe²⁺等，能利用这种能源的都是一些原核微生物，包括亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。

化学能源物质往往会与碳源、氮源等物质相重叠，使一种营养物充当两种或两种以上功能，因此也称之为双功能或多功能碳源。如无机物N属于双功能营养物（能源、氮源），有机物蛋白质、氨基酸属于三功能营养物（碳源、氮源、能源）。

二、微生物营养类型

由于微生物种类繁多，其营养类型也比较复杂，人们常在不同层次和侧重点上对微生物营养类型进行划分（表3-6）。根据碳源、能源及电子供体性质的不同，可将绝大部分微生物分为光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型及化能有机异养型四种类型（表3-7）。

（一）光能无机自养型

光能无机自养型，又称光能自养型，这是一类能以CO₂为唯一碳源或主要碳源并利用光能进行生长的微生物。它们能利用无机物如水、硫化氢、硫代硫酸钠或其他无机化合物使CO₂固定还原成细胞物质，并且伴随元素氧（硫）的释放。

藻类、蓝细菌和光合细菌属于这一类营养类型。

藻类和蓝细菌：

这与高等植物光合作用是一致的。

光合细菌：

这与藻类、蓝细菌和高等植物是不同的。

（二）化能无机自养型

化能无机自养型，又称化能自养型，这类微生物利用无机物氧化过程中放出的化学能作为它们生长所需的能量，以CO₂或碳酸盐作为唯一或主要的碳源进行生长，利用电子供体如氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等使CO₂还原成细胞物质。

属于这类微生物的类群有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌等。例如氢细菌：

（三）光能有机异养型

光能有机异养型，又称光能异养型，这类微生物不能以CO₂作为唯一碳源或主要碳源，需以有机物作为供氢体，利用光能将CO₂还原为细胞物质。

红螺属的一些细菌就是这一营养类型的代表：

光能有机异养型细菌在生长时通常需要外源的生长因子。

（四）化能有机异养型

化能有机异养型，又称化能异养型，这类微生物生长所需的能量来自有机物氧化过程释放出的化学能，生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、纤维素、有机酸等，化能有机异养型微生物利用的有机物通常既是它们生长的碳源物质又是能源物质。

目前在已知的微生物中大多数属于化能有机异养型，如绝大多数的细菌、全部真菌、原生动物以及病毒。

如果化能有机异养型微生物利用的有机物不具有生命活性，则是腐生型；若是生活在活细胞内从寄生体内获得营养物质，则是寄生型。

三、微生物营养吸收

微生物是借助生物膜的半透性及其结构特点来吸收营养物质和水分的。影响营养物质进入细胞的因素主要有三个：①营养物质本身的性质；②微生物所处的环境；③微生物细胞膜的透过屏障作用。

（一）单纯扩散

单纯扩散是一种最简单的物质跨膜运输方式，为纯粹的物理学过程，在扩散过程中不消耗能量，物质扩散的动力来自参与扩散的物质在膜内外的浓度差，营养物质由高浓度向低浓度扩散，不能逆浓度运输。物质扩散的速率随原生质膜内外营养物质浓度差的降低而减小，直到膜内外营养物质浓度相同时才达到一个动态平衡。

单纯扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式。水是唯一可以通过扩散自由通过原生质膜的分子，脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些气体分子（O₂、CO₂）及某些氨基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞。

（二）促进扩散

促进扩散指溶质在运送过程中，必须借助存在于细胞膜上的底物特异性结合载体蛋白的协助，但不消耗能量的一类扩散性运送方式。营养物质也是由高浓度向低浓度扩散，不能逆浓度运输。

促进扩散与单纯扩散的主要区别：通过促进扩散进行跨膜运输的物质需要借助于载体的协助作用才能进入细胞（图3-1），而且每种载体只运输能特异性结合的物质，具有高度的专一性。被运输物质与载体之间亲和力大小变化是通过载体分子的构象变化而实现的。参与促进扩散的载体主要是一些蛋白质，这些蛋白质能促进物质进行跨膜运输，底物在这个过程中不发生化学变化，而且在促进扩散中载体只影响物质的运输速率，并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态，被运输物质在膜内外浓度差越大，促进扩散的速率越快，但是当被运输物质浓度过高而使载体蛋白饱和时，运输速率就不再增加。

通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐等。

（三）主动运输

主动运输是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式（图3-2）。主动运输的一个重要特点是在物质运输过程中需要消耗能量，而且可以逆浓度运输。

主动运输须提供能量，并通过细胞膜上特异性载体蛋白构象的变化，而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内。由于它可以逆浓度梯度运送营养物，所以对许多生存于低浓度营养环境中的贫养菌的生存极为重要。主动运输的例子很多，主要有无机离子、有机离子（某些氨基酸、有机酸等）和一些糖类（乳糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蜜二糖以及阿拉伯糖、核糖等）。在大肠杆菌中，通过主动运输，运送1分子乳糖约消耗0.5分子ATP，而运送1分子麦芽糖则要消耗1.0～1.2ATP。

（四）基团移位

基团移位是指既需特异性载体蛋白的参与，又需耗能的一种物质运输方式，其特点是溶质在运送前后会发生分子结构的变化。

基团移位广泛存在于原核生物中，尤其是一些兼性厌氧型细菌和专性厌氧型细菌中，主要用于糖（葡萄糖、果糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺等）的运输，丁酸、核苷酸、腺嘌呤等也可通过这种方式运输。目前尚未在好氧型细菌及真核生物中发现这种运输方式，也未发现氨基酸通过这种方式进行运输。

在研究大肠杆菌对葡萄糖和金黄色葡萄球菌对乳糖的吸收过程中，发现这些糖进入细胞后以磷酸糖的形式存在于细胞质中，表明这些糖在运输过程中发生了磷酸化作用，其中的磷酸基团来源于胞内的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），因此称为磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸糖转移酶运输系统（PTS），简称磷酸转移酶系统（图3-3）。PTS通常由五种蛋白质组成，包括酶Ⅰ、酶Ⅱ（包括a、b和c三个亚基）和一种低分子量的热稳定蛋白质（HPr）。酶I和HPr是非特异性的细胞质蛋白，酶Ⅱ a是可溶性细胞质蛋白，亲水性酶Ⅱ b与位于细胞膜上的酶Ⅱ c相结合。在糖的运输过程中，PEP上的磷酸基团逐步通过酶Ⅰ、HPr的磷酸化与去磷酸化作用，最终在酶Ⅱ的作用下转移到糖，生成磷酸糖并释放于细胞质中。

四、培养基制作技术

培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合营养料。培养基中应含有满足微生物生长繁殖的六大营养要素（碳源、氮源、生长因子、无机盐、水分、能源），且比例适宜。制作培养基时，应配制完毕后立即灭菌，避免杂菌污染和破坏其固有成分和性质。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）、一定缓冲能力、一定的氧化还原电位和合适的渗透压等理化条件。

（一）配制培养基的原则

配制培养基应坚持以下原则：培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）；营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）；物理化学条件适宜（理化适宜）；根据营养目的来选择不同来源的材料（经济节约）。

1.目的明确

配制培养基之前，先要明确拟培养什么微生物、获何产物、用途是什么，根据不同的工作目的，选择适宜的营养物质。

总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物组成。

2.营养协调

微生物细胞内各种成分之间有相对稳定的比例。在大多数为化能异养微生物配制的培养基中，除水分外，碳源（兼能源）的含量最高，其后依次是氮源、常量元素和生长因子。

C/N是指培养基中所含C原子的摩尔浓度与N原子的摩尔浓度之比。不同的微生物菌种要求不同的C/N，同一种菌在不同生长时期都有不同的要求。C/N是培养基制备的一个重要因素。

一般来讲，真菌需C/N较高的培养基（似动物的“素食”），细菌尤其是动物病原菌需C/N较低的培养基（似动物的“荤食”）。

3.理化适宜

影响微生物生长的理化条件主要有pH值、渗透压、水分活度和氧化还原电位等条件。

（1）pH值　培养基的pH值必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，细菌适于在pH 6.5～7.5条件下生长，放线菌为pH 7.5～8.5，酵母菌为pH 3.8～6.0，霉菌为pH 4.0～5.8，藻类为pH 6.0～7.0，原生动物为pH 6.0～8.0。

值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，若不对培养基pH条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或（和）代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐（如K₂HPO₄和KH₂PO₄）组成的混合物。K₂HPO₄溶液呈碱性，KH₂PO₄溶液呈酸性，两种物质等量混合溶液的pH为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H⁺浓度增加时，H⁺与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物，培养基pH不会过度降低；如果培养基中OH^-浓度增加，OH^-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物，培养基pH也不会过度升高。

但K₂HPO₄和KH₂PO₄缓冲系统只能在一定的pH范围（pH 6.4～7.2）内起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，上述缓冲系统就难以起到缓冲作用，此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐（如CaCO₃等）作“备用碱”来进行调节，CaCO₃难溶于水，不会使培养基pH过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出CO₂，将培养基pH控制在一定范围内。

在培养基中还存在一些天然的缓冲系统，如氨基酸、多肽、蛋白质等都属于两性电解质，也可以起到一定缓冲剂的作用。

（2）渗透压　是某水溶液中一个可用压力来度量的理化指标，它表示两种不同浓度的溶液间若被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势的推动而透过隔膜流向浓溶液，直至浓溶液所产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为渗透压。渗透压的大小是由溶液中所含有的分子或离子的质点数决定的，等重的物质，其分子或离子越小，则质点数越多，因而产生的渗透压就越大。与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长，高渗溶液会使细胞发生质壁分离，低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，直至细胞破裂。

（3）水分活度（a_w）　表示微生物可利用的自由水或游离水的含量，其定义是指在同温同压下，某溶液的蒸气压（p）与纯水蒸气压（p₀）之比。各种微生物生长繁殖范围的a_w值在0.60～0.998。例如：

（4）氧化还原电位　也称氧化还原电势，是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。一般以E_h表示，是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值，单位是V（伏）或mV（毫伏）。

各种微生物对其培养基的氧化还原电位有不同的要求。一般好氧菌生长的E_h值为+0.3～+0.4V，兼性厌氧菌在+0.1V以上时进行好氧呼吸产能，在+0.1V以下时则进行发酵产能；而厌氧菌只能生长在0～+0.1V的环境中。在实验室中，为了培养严格厌氧菌，除应驱走空气中的氧外，还应在培养基中加入适量的还原剂，包括巯基乙酸、抗坏血酸、硫化钠、半胱氨酸、铁屑、谷胱甘肽、瘦牛肉粒等，以降低它的氧化还原电位。例如，加有铁屑的培养基，其E_h值可降至-0.40V的低水平。

测定氧化还原电位值除用电位计外，还可使用化学指示剂，例如刃天青等。刃天青在无氧条件下呈无色（E_h相当于-0.40mV）；在有氧条件下，其颜色与溶液的pH相关，一般在中性时呈紫色，碱性时呈蓝色，酸性时为红色；在微含氧溶液中，则呈现粉红色。

4.经济节约

配制培养基时，在能达到相同或相近效果的前提下，要尽可能选择原料易得、价格便宜、操作简便的培养基配制方法用于生产，降低成本，例如使用制糖生产废液、豆粕、米糠、花生饼等原料生产发酵，实现经济节约。

（二）培养基的类型

培养基常因分类依据不同而类型多样，实验中多以成分、物理状态、用途、生产目的等作为分类依据。

1.根据成分划分

（1）天然培养基　是指一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的培养基，其营养成分复杂、丰富、不稳定，难以说清其化学组成，也称非化学限定培养基。牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。

常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米浆、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、豆粕、花生饼、稻草浸汁、胡萝卜汁等。天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。

（2）合成培养基　是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。因由化学成分完全了解的物质配制而成，也称化学限定培养基，高氏一号培养基和查氏培养基就属于此类型。配制合成培养基时重复性强，但与天然培养基相比其成本较高，微生物在其中生长速度较慢，一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。

（3）半合成培养基　指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，培养真菌的马铃薯蔗糖培养基等。

2.根据物理状态划分

根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。

（1）固体培养基　是一类外观呈固态的培养基，由液体培养基中加入适量凝固剂配制而成。例如，加有1%～2%琼脂或5%～12%明胶的液体培养基，就可制成遇热熔化、冷却后呈凝固态的用途最广的固体培养基。

理想的凝固剂应具备以下条件：①不被所培养的微生物分解利用；②在微生物生长的温度范围内保持固体状态，在培养嗜热细菌时，由于高温容易引起培养基液化，可在培养基中适当增加凝固剂比例来解决这一问题；③凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长；④凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；⑤凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；⑥凝固剂要具有透明度好、黏着力强等特点；⑦凝固剂配制要使用方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶。表3-8列出琼脂和明胶的一些主要特性。

对绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂，琼脂是由藻类（海产石花菜）中提取的一种有高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物，是最早用来作为凝固剂的物质，但由于其凝固点过低，而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶，目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠及硅酸钾被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体，它不含有机物，适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。

（2）半固体培养基　是在液体培养基中加入少量的凝固剂配制而成，一般添加琼脂比例为0.2%～0.8%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。

（3）液体培养基　不加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。

3.根据用途划分

根据用途不同，将培养基划分为基础培养基、加富培养基、鉴别培养基和选择培养基。

（1）基础培养基　尽管不同微生物的营养需求各不相同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质。

（2）加富培养基　也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物。科研和发酵生产中，加富培养基也可以用来富集和分离某种微生物，这是因为加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质，该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，逐渐富集形成优势菌，并淘汰其他微生物，从而容易达到分离该种微生物的目的。从某种意义上讲，加富培养基类似选择培养基，但两者又存在一定的区别，加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使所需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。

（3）鉴别性培养基　是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基，我们称作鉴别培养基。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。最常见的鉴别培养基是伊红美蓝培养基，即EMP培养基。它在饮用水、牛奶等大肠菌群数细菌学检验和大肠杆菌的遗传学研究中有着重要的用途。EMP培养基成分见表3-9。

EMP培养基中的伊红、美蓝两种苯胺染料可抑制G⁺细菌和一些难培养的G^-细菌。在低酸度下，这两种染料会结合并形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。因此，试样中多种肠道细菌会在EMP培养基平板上产生易于用肉眼识别的多种特征性菌落，尤其是大肠杆菌，因其能强烈分解乳糖而产生大量混合酸，菌体表面带H⁺，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，故使菌落染上深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属光泽（类似金龟子色），其他几种产酸能力弱的肠道菌的菌落也会有相应的棕色，具体如下：

（4）选择性培养基　是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长，从而达到选择分离的目的。

选择培养基可分为两种类型：一种类型的选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的（投其所好）；另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物（取其所抗）。

四种常用的选择培养基如下：

①酵母菌富集培养基　葡萄糖5%，尿素0.1%，（NH₄）₂SO₄ 0.1%，KH₂PO₄ 0.25%，Na₂PO₄ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，FeSO₄·7H₂O 0.01%，酵母膏0.05%，孟加拉红0.003%，pH 4.5。

②Ashby 无氮培养基（富集好氧性自生固氮菌用）　甘露醇1%，KH₂PO₄ 0.02%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，NaCl 0.02%，CaSO₄·2H₂O 0.01%，CaCO₃ 0.5%。

③Martin培养基（富集土壤真菌用）　葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，琼脂2%，孟加拉红0.003%，链霉素30μg/mL，金霉素2μg/mL。

④含糖酵母膏培养基（在厌氧条件下富集乳酸菌用）　葡萄糖2%，酵母膏1%，KH₂PO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，pH6.5。

4.根据生产目的划分

根据培养基用于生产的目的，可以分为种子培养基、发酵培养基。

（1）种子培养基　是为保证发酵工业获得大量优质菌种而设计的培养基。这种培养基营养较为丰富，氮源比例较高，有时会特意地加入使菌种适应发酵条件的基质。例如味精产生菌北京棒杆菌AS.1299的一级种子（用摇床培养）培养基配方是：葡萄糖3%，玉米浆2.5%，尿素0.5%，K₂HPO₄ 0.1%，MgSO₄ 0.04%，pH 6.7～7.0。二级种子（1200L发酵罐）培养基配方是：用水解糖3%代替葡萄糖3%，其他成分都相同。这样做既保证了营养要求，又有利于适应下面的发酵条件。

（2）发酵培养基　是为使生产菌种能够大量生长并能累积大量代谢产物而设计的培养基。其特点是用量特别大，因此对发酵培养基的要求，除了要满足菌种需要的营养条件外，还要求原料来源广泛，成本比较低。所以这种培养基的成分一般都比较粗放，碳源的比例较大。例如柠檬酸发酵用的培养基，就只用红薯粉作原料，浓度高达22%，产酸在14%左右。

除了上述几类培养基外，还有专门用于培养病毒等寄生微生物的活组织培养基，如鸡胚等；专门用于培养自养微生物的无机盐培养基等。

思考与交流

1.微生物的营养物质有哪些？

2.微生物的营养类型有哪些？

3.培养基有哪些类型？

4.培养基配制原则是什么？